《新梁山伯与祝英台》讲述了东晋末年，吴越一带赵、祝两大富豪为争夺土地，世代结仇。时祝公远暗通都尉大人马俊升，竟将赵氏一家赶尽杀绝。赵夫人趁乱与幼子逃命，遇苏州统军梁守备，下嫁，其子改名梁山伯。
梁守备其后征讨水贼身亡，梁夫人二度守寡。?梁山伯读书有成，自幼脚程飞快，常奔走山野间助人。梁母变卖家当，筹得学费送儿子赴杭城尼山书院求学。祝公远独霸一方，其女祝英台聪明过人，也一心要到尼山求学。
英台于是与丫头吟心女扮男装，勉强说服爹娘让他上路。?梁山伯带着书童四九，在路上打抱不平。一次，山伯向扒手晓以大义时遇上麻烦，祝英台上前干涉，险遭围殴，幸得一壮汉排难解纷。梁、祝二人在柳荫亭结义，相伴上尼山。二人来到书院，遇上救命恩人路秉章。原来路是将门之后，他一心到尼山求学，日后为父报仇。山伯发现所带的银两都变成了石头，幸院仕夫人丁师母和女儿丁香认出他是路上仗义相助的青年，两人说服了丁夫子，勉强让山伯当杂役抵学费。
祝英台毕竟是女子，在书院有诸多不便，时时闹出笑话。书院中的恶少娄敬文等常在课堂闹事，他见英台举止软弱，平日尤喜加以捉弄，幸得山伯和秉章呵护。吟心担心小姐的身份被拆穿，于是献计要英台模仿路秉章，学他吐口水、说粗话。山伯不以为然，只有丁香被英台温文又粗犷的气质吸引，暗自喜欢。
这日，书院来了个叫如意的美女，原来她是路秉章的未婚妻，只因被朝阳县潘大人逼婚，特来投靠秉章。英台教如意如何扮作男人，反惹来如意的猜疑。英台担心身份被识穿，假意接受丁香的感情。如意被揭穿是女儿身，娄敬文向潘大人通风报信。潘派人把如意带走，路秉章夜闯朝阳县府，被捕下狱。如意为救爱人，答应嫁给潘。路获释，闯进县府要人，岂料如意竟惨死在潘大人刀下，路抱了如意的尸身狂奔而去。
祝英台向丁香说出自己是女子，两人成了知己。时富家子马文才入读尼山，这人正是宜兴知府马俊升之子，骄横放肆，只梁山伯一人不怕他。文才在一偶然机会下识破英台乃女儿身，且为一绝色美女，决意娶她为妻。这边厢英台只锺情山伯，仍未知自己乃山伯杀父仇人之女，而山伯却懵然不知英台乃女儿身。马文才和娄敬文收买梁山伯在乡试中为他们作弊，不果。二人在考场作弊被发现，马文才靠父荫逃过一劫，更诬陷梁山伯与娄敬文同谋，二人被判腰斩。
英台以美人计买通潘大人，对山伯从轻发落，英台被潘软禁。?吟心日夜兼程回乡，遇新任钦差大臣路秉章，山伯、英台得救。山伯高中乡试，英台亦以兄长祝威之名夺魁。马文才返家后，对英台念念不忘，欲娶她为妻。祝公远怕马家势力，假借妻子病危，促英台返乡。临别依依，英台几次提醒山伯自己是女儿身，无奈书呆子仍蒙然不知。英台只好佯称家中又个孪生妹妹，要山伯来娶。面对父母的逼婚，英台真要嫁给马文才不成？山伯从丁香处得知英台原来是女儿身，高兴莫名，但当他知道心上人竟是杀父仇人之女时，该当如何抉择？难道俩人最终只能含恨化蝶？
